【MTT法原理步骤】MTT法，全称为3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐法，是一种广泛应用于细胞活性检测的实验方法。该方法通过测定细胞代谢活性来评估药物对细胞的毒性或细胞增殖情况，常用于肿瘤研究、药物筛选及生物医学领域。

一、MTT法的基本原理

MTT法的核心原理是基于活细胞线粒体中的脱氢酶能够将外源性MTT（一种黄色的染料）还原为不溶于水的紫色结晶——甲臜（Formazan）。这一反应仅在具有活性的细胞中发生，因此，生成的甲臜量可以间接反映细胞的存活率和活性。

具体来说，当MTT被加入到培养液中后，活细胞内的线粒体脱氢酶会将其还原为甲臜，而死细胞由于缺乏代谢活性，无法完成此反应。随后，通过特定的溶剂（如DMSO）溶解形成的甲臜晶体，并使用分光光度计在特定波长（通常为570 nm）下测定吸光度值，从而定量分析细胞的活性。

二、MTT法的操作步骤

1. 细胞培养

在适当的培养基中接种目标细胞，使其在适宜条件下生长至一定密度。通常选择对数生长期的细胞以保证实验结果的准确性。

2. 药物处理

根据实验设计，向培养孔中加入不同浓度的药物或处理因素，设置对照组（空白对照、阴性对照等），并进行相应时间的孵育。

3. MTT溶液加入

在处理结束后，向各孔中加入适量的MTT溶液（通常为5 mg/mL），根据细胞类型和实验需求调整加入体积，然后继续孵育一定时间（一般为4小时左右）。

4. 去除培养液

孵育完成后，小心移除培养液，避免扰动已形成的甲臜晶体。

5. 溶解甲臜

向每个孔中加入适量的DMSO或其他溶剂（如异丙醇），轻轻振荡或放置在摇床上充分溶解甲臜晶体。

6. 测定吸光度

使用分光光度计在570 nm波长下测定各孔的吸光度值，同时可设定630 nm作为参考波长以消除背景干扰。

7. 数据分析

根据测得的吸光度值计算细胞存活率，常用公式为：

细胞存活率 = (实验组OD值 / 对照组OD值) × 100%

通过绘制剂量-效应曲线，进一步分析药物的半数抑制浓度（IC50）等参数。

三、MTT法的优势与局限性

优势：

- 操作简便，成本较低；

- 结果稳定，重复性较好；

- 应用范围广，适用于多种细胞类型。

局限性：

- 仅能反映细胞的代谢活性，不能完全代表细胞的总数；

- 部分细胞可能因形态变化导致甲臜沉淀不均；

- DMSO具有一定的细胞毒性，需控制使用浓度。

四、注意事项

- 实验过程中应严格控制温度、湿度等环境条件；

- MTT溶液需现配现用，避免长时间存放；

- 不同细胞系对MTT的反应可能存在差异，建议预实验优化条件；

- 数据分析时应注意排除异常值，提高结果的可信度。

总之，MTT法作为一种经典的细胞活性检测手段，在科研中发挥着重要作用。掌握其原理与操作流程，有助于提高实验的准确性与科学性。